天然产物新突破！榄香烯化身miR-145-5p结合稳定剂，精准抑制NSCLC生长

非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%，是肺癌领域的“致命挑战”，因早期诊断困难、晚期耐药频发导致患者5年生存率长期处于低位；尽管靶向治疗、免疫治疗等疗法不断进阶，但肿瘤异质性引发的疗效差异、耐药反复等问题，仍使临床对新型治疗机制与药物需求迫切。而MicroRNA（miRNA）作为基因表达调控的关键分子，在肿瘤发生发展中扮演“分子开关”角色，其中miR-145-5p是公认的抑癌miRNA，可通过靶向致癌基因抑制NSCLC细胞增殖，却因在肿瘤微环境中易被降解、稳定性不足严重限制功能发挥，因此如何保护这类抑癌miRNA的活性，成为肺癌研究的新突破口。

今天和大家分享一篇关于聚焦天然产物榄香烯（Elemene）在非小细胞肺癌（NSCLC）治疗中作用机制研究的文章，该文章于2024年10月发表在J Pharm Anal杂志上，标题为“Elemene as a binding stabilizer of microRNA-145-5p suppresses the growth of non-small cell lung cancer”。

01. 研究思路

本文围绕“阐明榄香烯抗非小细胞肺癌（NSCLC）的分子机制”展开：首先，通过患者来源异种移植（PDX）模型、细胞来源异种移植（CDX）模型，结合A549、H460等细胞系的体外实验，运用CCK-8法、流式细胞术、Western blot等技术，证实榄香烯可抑制NSCLC生长，并锁定NF-κB炎症通路为核心作用通路；其次，借助高通量miRNA测序技术筛选差异表达miRNA，结合OncomiR、dbDEMC等数据库交叉验证，再通过qRT-PCR、Northern blot技术验证，确定miR-145-5p是介导榄香烯作用的关键靶点；接着，利用miRTarBase、TargetScan等生物信息学工具筛选靶基因，通过双荧光素酶报告实验证实miR-145-5p直接结合MAP3K3的3'-UTR，再以Western blot、qRT-PCR技术验证二者的调控关系及对NF-κB通路的影响；随后，采用qRT-PCR、Northern blot、放线菌素D实验明确榄香烯通过抑制miR-145-5p降解（而非影响其合成）来提高其稳定性，通过微量热泳动（MST）技术测定结合亲和力（KD=0.39±0.17 μg/mL），结合分子对接技术阐明榄香烯结合miR-145-5p 3' 端胞嘧啶的作用模式；最后，通过慢病毒介导构建miR-145-5p过表达 / 敲低的稳定细胞系，开展体内外rescue实验，并结合免疫组化（IHC）技术，验证“榄香烯→miR-145-5p→MAP3K3→NF-κB”通路的特异性。全程以多维度技术手段系统揭示了榄香烯抗NSCLC的分子机制，为天然产物靶向miRNA的药物研发提供了新思路。

02. 主要研究内容

（1）榄香烯体外抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖

为明确榄香烯对非小细胞肺癌（NSCLC）的体外作用机制，研究以A549、H460 等细胞系为对象，经不同浓度榄香烯处理后，通过CCK-8法检测到细胞活力呈剂量依赖性显著下降，菌落形成实验进一步证实其抑制肿瘤细胞增殖（菌落数量与体积减少）。借助流式细胞术结合Western blot，发现榄香烯可诱导细胞周期S期阻滞（S期相关蛋白表达降低）；通过流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染色） 和免疫荧光成像，证实其提高凋亡率并触发细胞色素C释放，且Western blot检测到促凋亡蛋白上调、抗凋亡蛋白下调。划痕愈合实验与Western blot表明，榄香烯能抑制细胞迁移（迁移相关蛋白表达降低）。为验证通路参与，Western blot显示其降低IKKα/β、IκBα磷酸化水平，免疫荧光成像与Western blot证实抑制p65/p50核转位，GST pull-down和ChIP实验表明其减少p65/p50与COX-2启动子结合，最终Western blot检测到NF-κB下游炎症因子表达降低。综上，多技术协同证实榄香烯通过抑制增殖迁移、诱导周期阻滞与凋亡、调控NF-κB通路，显著抑制NSCLC细胞进展。

（2）榄香烯通过一种依赖于调控miR-145-5p的机制发挥其抗肿瘤作用

通过Western blot分析和qRT-PCR在细胞来源异种移植（CDX）模型、患者来源异种移植（PDX）模型及A549细胞系中证实其显著抑制MAP3K3的蛋白和mRNA 表达，再借助双荧光素酶报告实验和Western blot分析明确miR-145-5p可显著干扰榄香烯对MAP3K3的调控作用，通过菌落形成实验观察到miR-145-5p水平降低时，榄香烯诱导的菌落形成能力下降现象被部分逆转，证实榄香烯对体外肿瘤细胞生长的抑制依赖于miR-145-5p，提示其通过调控miR-145-5p/MAP3K3/NF-κB信号轴发挥抗癌作用；后续通过慢病毒介导的稳定细胞系构建（表达LV-anti-miR-145-5p或 LV-anti-miR-NC），在裸鼠体内构建NSCLC模型，发现miR-145-5p敲低组中榄香烯的抗肿瘤效能显著降低，再经Western blot分析检测到体内敲低miR-145-5p可缓解 MAP3K3表达降低、提高NF-κB信号通路活性并逆转榄香烯对COX-2、IL-6、TNF-α 等蛋白的下调作用，最终通过免疫组化（IHC）实验验证上述结论，明确榄香烯抑制非小细胞肺癌（NSCLC）进展的作用至少部分由miR-145-5p介导。

(3) 榄香烯通过阻断miR-145-5p的降解来增加其丰度

榄香烯通过直接结合miR-145-5p阻断其降解，进而增加该miRNA的丰度：首先借助qRT-PCR技术分析榄香烯处理后成熟miR-145-5p及其前体（pri-/pre-miR-145-5p）的浓度，证实其仅显著提高成熟miR-145-5p的丰度；随后通过Northern blot实验进一步验证，明确榄香烯仅特异性升高成熟miR-145-5p水平，对其前体无影响，从而排除了通过调控生物合成增加丰度的可能性。为明确榄香烯对miR-145-5p的降解抑制作用，在RNA合成抑制剂放线菌素D存在的条件下进行稳定性实验，结果证实榄香烯能有效阻断miR-145-5p的降解。细胞裂解物共孵育实验显示，预先与榄香烯孵育的miR-145-5p降解程度显著降低，但miR-145-5p与经榄香烯预处理的细胞裂解物共孵育时，降解无明显变化，这表明榄香烯是通过直接结合miR-145-5p发挥稳定作用，而非抑制RNA降解酶的活性。进一步通过分子对接技术模拟二者相互作用，发现榄香烯优先结合miR-145-5p的3'端，通过非极性范德华力与该区域 C20−C22位的胞嘧啶结合。最后，微量热泳动（MST）技术测定结果显示，野生型 miR-145-5p与榄香烯的解离常数（KD=0.39±0.17 μg/mL）远低于突变体。综上，榄香烯在不改变miR-145-5p生物合成途径的前提下，通过直接结合增强其稳定性，最终实现miR-145-5p丰度的增加。

03. 参考文献

Zhou MR, Wang JY, Peng YL, et al. Elemene as a binding stabilizer of microRNA-145-5p suppresses the growth of non-small cell lung cancer. J Pharm Anal. 2024, 15(3):101118. Doi: doi.org/10.1016/j.jpha.2024.101118