从实验室到产业：香榧采后萜烯合成调控新突破，为坚果品质改良提供新靶点

香榧（Torreya grandis）是我国特有的珍稀坚果，不仅以酥脆口感广受喜爱，更因富含萜类化合物，兼具抗氧化、抗菌等保健价值 —— 而萜类化合物的含量与组成，正是决定香榧风味层次、营养价值乃至商品价值的核心因素。在萜类合成通路里，香叶基焦磷酸合成酶（GPPS） 编码基因TgGPPS 是关键“枢纽”：它催化生成的香叶基焦磷酸（GPP），是单萜、二萜等众多重要萜类的共同前体，TgGPPS 的表达水平直接决定香榧坚果中萜类物质的积累效率。不过，哪些转录因子能精准靶向TgGPPS，又如何通过协同作用调控其表达，长期以来并不明确，这也成了香榧品质定向改良的关键瓶颈。

今天和大家分享一篇关于聚焦香榧萜类合成调控机制的研究文章，该文章于2023年7月发表在Plant Physiol杂志上，标题为“Transcription factors TgbHLH95 and TgbZIP44 cotarget terpene biosynthesis gene TgGPPS in Torreya grandis nuts”。

01. 研究思路

本文围绕香榧坚果采后萜烯合成的调控机制展开研究。首先，采用转录组测序技术对采后0、4、8、12天的香榧坚果进行分析，鉴定出156个萜类代谢通路基因，结合GC-MS检测的萜烯含量数据，通过相关性分析（R=0.83，P<0.001）筛选出关键基因TgGPPS；随后，利用序列比对（确认 DD (X) 2-4D 特征基序）、亚细胞定位（叶绿体定位，共聚焦激光扫描显微镜观察）、烟草叶片瞬时过表达（单萜含量提高1.6倍）及番茄果实稳定过表达（单萜含量提高1.3-3.3倍）技术，验证TgGPPS对单萜合成的核心作用；接着，基于双荧光素酶报告系统从15个共表达转录因子中筛选出3个可激活TgGPPS启动子的bHLH家族成员（TgbHLH95激活效应最强），再通过酵母单杂交（Y1H）筛选出可直接结合 TgGPPS启动子的TgbZIP44，并借助凝胶阻滞实验（EMSA）明确其结合位点为ACGT 元件；最后，通过双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）、共免疫沉淀（Co-IP）及GST pull-down技术，证实TgbHLH95与TgbZIP44形成蛋白复合物，二者协同将TgGPPS启动子激活效应提升至4.68倍，最终揭示“TgbHLH95/TgbZIP44复合物激活TgGPPS表达以促进香榧采后萜烯合成”的调控机制。

02. 主要研究内容

（1）TgGPPS过表达对烟草叶片和番茄果实萜烯合成的影响

为明确香榧（Torreya grandis）中TgGPPS（香叶基焦磷酸合酶基因）的功能，研究人员先通过序列比对技术发现，TgGPPS含萜烯合成关键的天冬氨酸富集基序，具备酶功能基础；再经系统发育树构建技术，确定其与裸子植物挪威云杉叶绿体定位且调控萜烯合成的PaGPPS聚为一支，后续借助本氏烟草叶片亚细胞定位实验（共聚焦观察），进一步证实TgGPPS定位于叶绿体，与单萜合成的MEP通路场所一致。随后通过农杆菌介导的瞬时表达技术，将TgGPPS-SK载体或空载体导入烟草（N. tabacum）叶片，1周后经气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）检测，显示过表达叶片总单萜含量较对照提升1.6倍，α- 萜品烯、柠檬烯分别增加4.8倍、4.4倍；同时采用稳定转基因技术构建番茄（品种 MicroTom）TgGPPS过表达株系，筛选3个高表达株系，经实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）确认基因高效表达后，GC-MS检测发现其单萜含量较野生型提升 1.3-3.3倍，α- 蒎烯、β- 蒎烯增幅显著。表明TgGPPS是香榧采后成熟过程中萜烯生物合成的关键基因，通过催化GPP生成推动单萜积累，支撑坚果香气品质形成。

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（2）TgbZIP44在萜烯生物合成中发挥直接调控作用

为明确TgbZIP44在萜烯生物合成中的作用，研究人员先通过双荧光素酶报告实验及烟草叶片瞬时过表达实验，发现TgbHLH95可反式激活TgGPPS启动子但无法直接结合，进而采用酵母单杂交实验分析其他差异表达转录因子与TgGPPS启动子的相互作用，结果显示TgERF2、TgRAV3、TgbZIP44在200 ng/mL Aureobasidin A（AbA）培养基上可正常生长（空载体无法生长），证明三者能直接结合TgGPPS启动子；随后通过双荧光素酶报告实验筛选协同因子，发现TgbHLH95与TgbZIP44组合对TgGPPS 启动子的诱导效应最强（LUC/REN比值4.68），显著高于TgbHLH95或TgbZIP44单独作用（分别为1.21倍、0.64倍激活），故选定TgbZIP44深入研究。通过实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测到TgbZIP44与TgGPPS表达模式一致，均在采后4-8天显著上调；借助凝胶阻滞实验（EMSA）证实，TgbZIP44可直接识别并结合TgGPPS启动子的 ACGT元件（ACGT突变为AAAA后结合消失，冷探针浓度升高则结合亲和力降低）；同时通过亚细胞定位实验观察到TgbZIP44在细胞核呈强荧光信号，确认为核定位蛋白，为其与TgbHLH95在核内形成蛋白相互作用提供基础，最终明确TgbZIP44在萜烯生物合成中的直接调控角色。

（3）TgbHLH95/TgbZIP44复合物激活TgGPPS启动子

为验证TgbHLH95与TgbZIP44能否形成复合物并激活TgGPPS启动子，研究人员首先采用瞬时双分子荧光互补（BiFC）实验，将TgbHLH95与TgbZIP44分别构建至YFP的N端/ C端载体并共转化本氏烟草叶片，结果显示二者共转化组在细胞核检测到 YFP荧光信号，而单一构建体或空载体等阴性对照无信号，证明二者可在核内互作；随后用荧光素酶互补成像（LCI）实验进一步验证，将TgbHLH95与TgbZIP44分别融合荧光素酶的N端（nLUC）/ C端（cLUC）并共浸润烟草叶片，共转化组检测到强 LUC发光信号，阴性对照无信号，佐证互作关系；为确认体内互作，开展免疫共沉淀（Co-IP）实验，用抗GFP抗体沉淀烟草叶片中TgbZIP44-GFP融合蛋白，经免疫印迹发现其可结合TgbHLH95，而GFP对照无结合；最后通过体外GST pull-down实验，将重组TgbHLH95-GST与TgbZIP44-His蛋白孵育后用GST磁珠洗脱，免疫印迹显示 TgbHLH95-GST可拉取TgbZIP44-His，单独GST则不能，证实二者直接互作。综上，BiFC、LCI、Co-IP及GST pull-down四项技术共同证明TgbHLH95与TgbZIP44可在体内外形成蛋白复合物。

03. 参考文献

Zhang ZY, Tao L, Gao LL, et al. Transcription factors TgbHLH95 and TgbZIP44 cotarget terpene biosynthesis gene TgGPPS in Torreya grandis nuts. Plant Physiol. 2023, 193(2):1161–1176. doi: 10.1093/plphys/kiad385