从靶点到候选药：FtsZ-SepF互作成抗结核新方向，T0349高效安全双在线

在全球公共卫生领域，耐药结核病（DR-TB）正成为日益严峻的“健康海啸”——2023年全球新发耐药结核病例达42.6万例，治疗成功率仅58%，且现有药物存在靶点单一、易诱发耐药、副作用显著等瓶颈。结核分枝杆菌的顽固性根源在于其复杂的生存机制，而细菌分裂过程作为“致命软肋”，始终是新药研发的核心靶标池。其中，FtsZ 蛋白作为细菌版“细胞骨架”，通过GTP依赖的聚合形成Z环驱动细胞分裂，被视为抗结核药物开发的黄金靶点，但其单靶点抑制剂因细菌快速突变导致的耐药风险，始终难以突破临床转化困境。

今天和大家分享一篇关于聚焦抗耐药结核新药研发的突破性研究的文章.该文章于2023年Acta Pharm Sin B杂志上，标题为“Identification of anti-Mycobacterium tuberculosis agents targeting the interaction of bacterial division proteins FtsZ and SepFe”。

01. 研究思路

本文围绕“开发抗耐药结核新药”展开，首先针对现有FtsZ抑制剂靶向GTP酶活性易耐药的痛点，通过酵母双杂交技术验证Mtb特有的FtsZ-SepF互作是分裂关键，确立新靶点；随后基于该技术构建筛选体系（用酵母菌株AH109共表达FtsZ/SepF融合蛋白），从1万种化合物中筛选出候选物T0349；接着通过GST pull-down、荧光偏振（FP）、表面等离子体共振（SPR） 技术，从分子层面证实T0349特异性结合SepF（KD≈47 μmol/L）、阻断FtsZ-SepF互作，再用光散射实验、GTP 酶检测（孔雀绿法）明确其不影响FtsZ的GTP酶活性、仅抑制SepF介导的FtsZ聚合；基因层面借助CRISPRi技术构建耻垢分枝杆菌sepF敲低/过表达菌株，双向验证T0349靶点为SepF；细胞层面通过HADA荧光标记结合显微镜观察，发现T0349致Mtb近缘菌丝状体化、异常隔膜，证明其破坏分裂；最后评估活性时，T0349对敏感株、MDR/XDR株MIC达1-4μg/mL（媲美一线药），对其他细菌MIC>32 μg/mL（高选择性），小鼠急性毒性实验（LD50>500 mg/kg）证安全性。该研究通过完整技术链验证，不仅确立了 FtsZ-SepF互作这一抗结核新靶点，提供了作用机制新颖的候选药物，还验证了 CRISPRi等技术在抗结核药物研发中的应用价值，为新型抗结核药物研发提供了关键靶点与候选分子。

02. 主要研究内容

（1）酵母双杂交法检测FtsZ/SepF的相互作用

为筛选能抑制结核分枝杆菌（Mtb）FtsZ/SepF相互作用的化合物，研究团队采用了此前用于筛选靶向L12/L10相互作用抗结核药物的酵母双杂交系统，具体构建了 AH109（pAD-FtsZ + pBD-SepF）与AH109（pAD-SepF + pBD-FtsZ）两种重组酵母菌株（Mtb的ftsZ基因分别与GAL4转录因子激活域AD、sepF基因分别与结合域BD融合），其检测原理为FtsZ与SepF若相互作用，会带动GAL4的AD与BD形成完整转录因子，进而激活报告基因ADE2、HIS3、LacZ，故可通过酵母在SD/-Leu-Trp-Ade-His 选择性培养基上的生长情况及以ONPG为底物的β- 半乳糖苷酶（β-gal）活性判断二者互作；结果显示，上述两种重组菌株均能在该选择性培养基上良好生长且β-gal活性阳性，阳性对照AH109（pAD-T + pBD-53）结果一致，阴性对照AH109（pAD-T + pBD-lam）无法生长，仅单独表达pAD-FtsZ或pBD-SepF的酵母也无生长及阳性β-gal活性（排除自激活），且Western blot验证了FtsZ与SepF在酵母中均成功表达 ，最终证实Mtb的FtsZ与SepF存在特异性相互作用，且该酵母双杂交系统可有效验证此相互作用。

（2）T0349破坏FtsZ与SepF的相互作用

为了确定T0349是否会消除FtsZ/SepF相互作用，研究人员首先借助GST下拉实验，在大肠杆菌中纯化GST-FtsZ与GST蛋白，以GST-FtsZ为诱饵证实FtsZ与SepF 的强相互作用（仅GST-FtsZ可下拉到His-SepF），后续加入不同浓度T0349孵育，通过Western blot发现His-SepF下拉量呈剂量依赖性降低，而GST-FtsZ不受影响，证明T0349可破坏二者结合；接着采用FP技术（分析蛋白互作的定量技术），合成FITC 标记的FtsZ关键互作区域肽段（FITC-FtsZ，363-379aa），纯化SepF的FtsZ互作区域片段（SepFc，115-203aa），以50 nmol/L FITC-FtsZ为探针检测到FtsZ与SepFc互作的Kd为18.57 nmol/L，加入T0349后其对二者互作的抑制呈剂量依赖性，IC50为 20.42 μmol/L；最后运用SPR技术（精准定量分子结合的技术），将His-FtsZ、His-SepF分别包被CM5传感芯片，测得FtsZ与SepF互作的KD为1.13 μmol/L，FtsZ与 SepFc互作的KD为5.16 μmol/L，进一步检测T0349的结合靶点发现，其可结合SepF（KD=47.7 μmol/L）与SepFc（KD=46.75 μmol/L），但不结合FtsZ，所有技术结果共同证实：T0349通过结合SepF 的C端互作区域（SepFc），破坏FtsZ/SepF的相互作用。

(3) T0349在ftsZ或sepF敲低及过表达菌株中的敏感性测定

为明确T0349的作用靶点，研究利用CRISPR干扰（CRISPRi）技术（通过共表达催化失活的dcas9与sgRNA靶向抑制特定基因）构建了ftsZ或sepF敲低菌株，采用aTc 诱导型dcas9系统（dcas9表达受aTc调控），在耻垢分枝杆菌中验证显示：设计靶向 ftsZ/sepF的sgRNA后，经≥4ng/mL aTc 处理12小时，可使两基因表达抑制至少 90%（RT-qPCR 检测），且200ng/mL aTc处理48小时仍能维持80%以上敲低效率（系统稳定性良好）；通过刃天青实验（以荧光值反映细胞活力）检测敏感性发现，相同浓度T0349（0-4μg/mL）处理下，sepF敲低菌株活力显著低于野生型（敏感性升高），而ftsZ敲低菌株活力与野生型无差异；为进一步验证，构建pMV261-FtsZ和 pMV261-SepF过表达质粒（经 β-gal 活性验证），结果显示sepF过表达菌株在相同 T0349处理下活力显著高于野生型（敏感性降低），ftsZ过表达菌株则无差异。综上，敲低与过表达菌株的敏感性分析双向证实SepF是T0349的作用靶点。

03. 参考文献

Zhang HJ, Cheng Y, Zhang Y, et al. Identification of anti-Mycobacterium tuberculosis agents targeting the interaction of bacterial division proteins FtsZ and SepFe. Acta Pharm Sin B. 2023, 13(5):2056–2070. doi: 10.1016/j.apsb.2023.01.022