探索co-IP实验：问题解决方案助你成功co-IP

原理简介：免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation，co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是特异性抗体捕获样品中的靶蛋白，形成抗体-靶蛋白复合物，然后利用能够与抗体结合的支持物来固定和沉淀复合物，此时与靶蛋白相互作用的蛋白也会被沉淀下来，最后洗去与靶蛋白相结合的非特异性蛋白，再通过SDS-PAGE进行分析、Western blot检测目标蛋白的有无来确定两个蛋白之间是否互作。

co-IP实验中常见的问题与解决方案：

一、co-IP 实验成功的评判标准是什么？

所有的Input都有目的条带，IP后阴性对照无目的条带，互作组有或者无目的条带说明co-IP成功。

IP产物在质谱检测中鉴定到的蛋白数量不能作为判断实验成败的标准，因为这取决于目的蛋白本身所具有的互作蛋白数量、结合力强弱等方面。

二、co-IP实验成败的主要因素有哪些？

1.所使用的抗体需要较高的亲和力、特异性；

2.当蛋白互作须发生在特定条件、组织细胞类型之中时，co-IP实验可能无法获得互作结果；

3.诱饵蛋白和或捕获蛋白在样本中的丰度；

4.两个互作蛋白的亲和力；

5.蛋白互作需要较特定的溶液条件（特定的离子）；

6.样品处理、蛋白提取存在难度；

三、免疫共沉淀（co-IP）实验目的蛋白高背景产生的原因及处理方法?

目的蛋白高背景产生的原因有很多种，比如：1、有非特异性蛋白结合；2、膜上的非特异性吸附；

处理方法：针对有非特异性蛋白结合这种情况，可以适量增加去污剂的量，比如Tween-20；对于转移摸上的非特异性吸附，可以增加膜的封闭时间，其次要注意实验的操作问题，一定要戴手套，用镊子夹取，以及不接触转移膜转移面。

四、用co-IP验证出两个蛋白互作，但是其他验证方式却不互作，是不是co-IP结果不真实？

结果真实可靠，因为co-IP中可能存在中间蛋白参与互作过程，说明这两个目的蛋白之间的互作是间接互作的。

五、其他方式能验证出两个蛋白之间有相互作用，用co-IP却没有验证出来的原因？

IP有一定的灵敏度，对于有些弱相互作用、瞬时互作或由于蛋白表达量太低而检测不出来的，属于正常范畴。

六、co-IP中的input/IP/IB分别是指什么？

Input指的是总蛋白，证明co-IP体系里存在目的蛋白；IP是用相应的抗体沉淀相应的蛋白；IB指互作信号。

七、co-IP实验如何避免出现假阳性？

1、确保实验过程严谨，防止交叉污染；

2、选择特异性高的抗体；

3、增加co-IP最后一步的洗涤次数。

八、co-IP实验中阴性对照的意义是什么？

排除两个目的蛋白的互作不是由于非特异性结合引起的。

九、co-IP实验中如何去除重链、轻链的影响？

用目前商业化的纳米抗体可以有效避免，或者在WB的过程用特异性二抗去排除。

十、co-IP实验失败的原因及解决方法有哪些？

1、目的蛋白发生严重的降解；处理方法：添加蛋白酶抑制剂（protease inhibitor）；所有操作保持4℃以下的低温操作。

2、抗体亲合力太低；处理方法：换抗体，选用适合于IP或IB的相应抗体。

3、Tag未暴露在融合蛋白构象的表面；处理方法：改变tag融合表达部位。

4、蛋白容易变性；处理方法：换温和的裂解液。