关于大肠杆菌表达纯化的常见问题与解答

大肠杆菌表达是指通过基因克隆技术，将外源目的基因导入大肠杆菌表达菌株，使其在特定条件下进行表达。在实验过程中，可能会遇到一些常见问题，下面是一些主要问题及其解答：

1、大肠杆菌表达诱导条件如何摸索，如何选择？

大肠杆菌表达是在特定条件下进行的，它的表达条件：IPTG浓度，表达温度，表达时间对表达的结果有着重要的影响。在进行大肠杆菌表达纯化实验之前，我们可以进行预实验，设置IPTG浓度梯度，表达温度梯度，表达时间梯度，再通过Western blot来确认表达效果，从而选择最佳的表达条件。

2、有时候大肠杆菌表达出来的蛋白可溶性低，该如何解决？

大肠杆菌表达出来的蛋白容易发生错误折叠，从而使目的蛋白形成包涵体呈不可溶状态，为了解决这一问题，可以尝试降低诱导温度，诱导时间以及IPTG的浓度；还可以换目的蛋白标签，更换表达载体和表达菌种。

3、如何提高目的蛋白纯化效率？

有时候在进行目的蛋白纯化时，发现目的蛋白纯化效率低，纯化效果差，为了解决这一问题，可以选择质量更好的beads和抗体（特异性高），甚至更换目的蛋白标签。

4、蛋白如何长期保存？

表达出来的蛋白立马用于后续实验，如果暂时不用，可以在纯化的蛋白溶液中加入适量的甘油，并将蛋白保存至-80 ℃冰箱里。

5、如何解决蛋白无法表达的问题？

在实际实验中，并不是所有的蛋白都可以通过原核菌表达出来，在这种情况下，我们需要针对目的蛋白进行密码子优化来促进表达；另外，还需要选择更加合适的表达载体和对应的表达菌株。如果以上方法都无法表达出目的蛋白，可以尝试使用真核（酵母）表达体系进行实验。